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【百科】液相色譜儀工作原理
  • 發布日期:2025-11-13      瀏覽次數:663
    • 液相色譜儀是利用混合物中各組分在固定相和流動相之間分配系數的差異,實現分離、分析的精密儀器,廣泛應用于化學、制藥、環境等領域。其核心工作原理基于色譜分離理論,具體流程如下:

      一、基本原理:分配系數差異驅動分離

      1. 固定相:色譜柱內填充的多孔顆粒材料(如硅膠、聚合物等),根據分離模式(反相、正相、離子交換等)具有不同極性或化學特性。

      2. 流動相:攜帶樣品通過色譜柱的液體(如甲醇、乙腈、緩沖鹽溶液等),其極性和組成可調節分離效果。

      3. 分離機制

        • 樣品注入后,各組分在流動相推動下進入色譜柱。

        • 極性低的組分與非極性固定相(如 C18)作用力強,在柱內保留時間長;極性高的組分與固定相作用力弱,隨流動相快速流出。

        • 不同組分因分配系數差異,在柱內遷移速度不同,最終按順序流出色譜柱,實現分離。

      二、核心組件與功能

      1. 輸液系統
        • 高壓泵:提供穩定流量的流動相(壓力可達幾十兆帕),確保樣品在柱內快速遷移。

        • 溶劑管理器:混合多種流動相(如梯度洗脫),精確控制比例和流速。

      2. 進樣系統
        • 進樣器:將樣品定量注入流動相(如手動進樣閥或自動進樣器),避免外界干擾。

      3. 分離系統
        • 色譜柱:核心部件,內徑通常 1-4.6 mm,長度 50-250 mm,固定相填充其中。不同類型色譜柱(如反相柱、親水作用柱)適用于不同樣品。

      4. 檢測系統
        • 紫外 - 可見檢測器(UV-Vis):檢測有紫外吸收的組分(如芳香族化合物)

        • 示差折光檢測器(RID):通過折射率變化檢測無紫外吸收的物質(如糖類),但靈敏度較低。

        • 熒光檢測器:檢測熒光物質(如維生素、藥物代謝物),靈敏度高。

        • 質譜檢測器(LC-MS):與質譜聯用,提供分子結構信息,適用于復雜樣品分析。

      5. 數據處理系統
        • 記錄色譜峰的保留時間、峰面積等參數,通過軟件計算組分含量或純度。

      三、關鍵分離模式與應用場景

      1. 反相色譜(RP-HPLC)
        • 固定相:非極性(如 C18、C8),流動相為極性溶劑(水 + 甲醇 / 乙腈)。

        • 應用:分離極性中等至非極性化合物(如藥物、脂肪酸、激素)

      2. 正相色譜(NP-HPLC)
        • 固定相:極性(如硅膠、氨基柱),流動相為非極性溶劑(正己烷、異丙醇)。

        • 應用:分離極性化合物(如糖類、甘油酯、手性異構體)。

      3. 離子交換色譜(IEC)
        • 固定相:帶電荷基團(如磺酸基、季銨基),通過靜電作用分離離子型物質(如氨基酸、核酸、有機酸)。

      4. 尺寸排阻色譜(SEC)
        • 固定相:多孔凝膠,按分子尺寸分離(大分子先流出,小分子后流出),用于聚合物分子量分析、蛋白質純化等。

      四、典型工作流程

      1. 系統平衡:用初始流動相沖洗色譜柱,直至基線穩定。

      2. 樣品進樣:通過進樣器將樣品注入流路,隨流動相進入色譜柱。

      3. 分離過程:組分在柱內按分配系數差異先后流出色譜柱。

      4. 檢測與記錄:檢測器實時監測流出組分,生成色譜圖(橫坐標為保留時間,縱坐標為信號強度)。

      5. 結果分析:根據保留時間定性(與標準品對比),峰面積或峰高定量(外標法、內標法)。

      五、優勢與局限性

      • 優勢
        • 分離效率高,可分析復雜混合物(如中藥提取物、生物樣品)。

        • 檢測靈敏度高(UV 檢測器可達微克級,MS 檢測器可達皮克級)。

        • 流動相選擇靈活,適用于極性 / 非極性、熱不穩定化合物(無需高溫汽化,優于氣相色譜)。

      • 局限性
        • 樣品需溶解于液體,不能直接分析氣體或固體。

        • 色譜柱易被污染,需定期維護。

        • 梯度洗脫時,流動相更換和平衡時間較長。

      六、應用領域

      • 制藥行業:藥物純度檢測、雜質分析、手性分離(如布洛芬對映體)。

      • 環境監測:水中農藥殘留(如有機磷、除草劑)、多環芳烴(PAHs)分析。

      • 食品分析:添加劑(如防腐劑、色素)、維生素、真菌毒素(如黃曲霉毒素)檢測。

      • 生物化學:蛋白質分離(如單抗藥物)、核酸純化、代謝物分析(如 LC-MS 代謝組學)。

       

      液相色譜儀通過精準控制分離條件,實現了復雜樣品的高效分析,其技術不斷向高速度(如超高效液相色譜 UPLC)、高靈敏度(如聯用質譜)方向發展,成為現代分析化學的核心工具之一。

       

       

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